莫纯聪^1,2*，王忠芳^1,2*，刘冬兰^2*，杨小云^2*，张琼²，叶丽华¹，原帅³，邓世东¹，赖竹兰²，黄德毅¹，杨玉洁^1,2，许多²，朱育慧¹，刘好怡¹周承星²，廖小红²，李潇¹，刘文宽¹，周荣^1,2*，田新贵^1*

¹广州医科大学附属第一医院呼吸系统疾病全国重点实验室，广州呼吸健康研究院，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，国家呼吸医学中心，广州医科大学，广东省广州市，510182

²广州国家实验室，广东省广州和市，510005

³海关技术中心卫生检疫研究所，广东省广州市，510700

^*通信作者：田新贵(xgtian@gzhmu.edu.cn)，周荣(zhourong@gird.cn).

^*莫纯聪，王忠芳，刘冬兰和杨小云为本文共同第一作者

目的

腺病毒六邻体可容纳外源短肽，并且不会影响腺病毒本身的稳定性。SpyCatcher/SpyTag可自发形成异肽键，SpyTag是一种16个氨基酸的短肽，可以嵌入腺病毒六邻体。本研究以表位嵌合型人3型腺病毒（rAd3/7）为骨架，构建展示SpyTag标签的重组腺病毒rAd3/7-SpyTag，与融合SpyCatcher的RBD蛋白共孵育，作为新冠病毒疫苗候选。

方法

1.我们保留了HAdV-3和HAdV-7的中和表位HVR1和HVR5，采用反向遗传技术，在文献已报道可在腺病毒六邻体嵌入短肽的高变区（HVR2、HVR4和HVR7）分别嵌入SpyTag标签，通过体外转染，拯救重组腺病毒rAd3/7-SpyTag。

2.融合SpyCatcher的BA5-RBD蛋白采用CHO细胞进行表达和纯化。

3.纯化后的rAd3/7-SpyTag和SpyCatcher-RBD蛋白体外孵育结合形成纳米颗粒rAd3/7-SpyRBD，通过Western blot、ELISA、纳米粒度分析仪和负染电镜等方法进行分析和表征。

4.rAd3/7-SpyRBD免疫BALB/c小鼠，通过ELISA和中和实验分析检测抗HAdV-3、HAdV-7和RBD的抗体动力学、效价及中和滴度；使用ELISPOT检测细胞因子IFN-γ和IL-4，ELISA检测IgG抗体亚类水平，探讨rAd3/7-SpyRBD诱导的T细胞免疫类型。

5.在动物模型上验证rAd3/7-SpyRBD的保护作用：rAd3/7-SpyRBD免疫K18-hACE2小鼠，加强免疫三次，并设SpyCatcher-RBD和PBS免疫小鼠对照；免疫后小鼠滴鼻感染BA5.2，监测小鼠体重和存活率至感染后第10天，在感染第3天每组收取3只小鼠的肺组织，检测肺部病毒滴度和病理变化。

结果

1.制备了三种重组腺病毒质粒，分别于HVR2、HVR4和HVR7嵌入SpyTag标签，最终成功拯救在HVR4嵌入SpyTag的重组腺病毒rAd3/7-SpyTag。

2.重组蛋白SpyCatcher-RBD在CHO细胞中成功表达并纯化。

3.Western blot结果显示，Spike单抗可特异性识别rAd3/7-SpyRBD约210 kDa的条带；ELISA板包被rAd3/7-SpyTag，仅加入SpyCatcher-RBD蛋白可被Spike单抗识别；纳米粒度分析仪测量rAd3/7-SpyRBD粒径为143.3nm，rAd3/7-SpyTag粒径为128.7nm；负染电镜观察rAd3/7-SpyRBD直径约为88.1nm，rAd3/7-SpyTag直径约为84.5nm。这些结果表明SpyCatcher-RBD成功结合并展示在rAd3/7-SpyTag纳米颗粒表面。

4.相较SpyCatcher-RBD，rAd3/7-SpyRBD免疫小鼠可更快的诱导产生RBD抗体，产生的RBD抗体滴度更高。诱导更高水平的RBD特异性IL-4和IgG1，rAd3/7-SpyRBD可能诱导更强的Th2免疫反应。中和实验表明，接种两组疫苗的免疫小鼠血清均可有效中和BA5.2病毒，但中和抗体滴度无显著性差异（P>0.05）；rAd3/7-SpyRBD免疫小鼠抗血清可以有效中和HAdV-3和HAdV-7。在小鼠攻毒免疫保护实验中，PBS免疫对照组100%死亡，而rAd3/7-SpyRBD和SpyCatcher-RBD免疫组小鼠无死亡，疫苗免疫显著降低了肺组织的病毒载量。

结论

1.成功制备展示SpyTag标签的重组腺病毒rAd3/7-SpyTag，可在体外孵育结合SpyCatcher融合蛋白，可以作为一种通用的纳米颗粒疫苗平台。

2.制备了一种纳米颗粒疫苗候选rAd3/7-SpyRBD，可快速诱导抗体的产生，产生更强的免疫应答。SpyCatcher-RBD和rAd3/7-SpyRBD均能对K18-hACE2小鼠提供免疫保护作用，可作为SARS-CoV-2疫苗候选。

3.rAd3/7-SpyRBD可诱导HAdV-3和HAdV-7中和抗体的产生，可作为腺病毒疫苗候选。

关键词：腺病毒；SARS-CoV-2；纳米颗粒；疫苗