摘要：糖尿病足（DF）是糖尿病的严重并发症之一，是导致非外伤性截肢的首要原因，每 20 秒钟就有一位患者因为糖尿病而截肢，85% 的截肢由糖尿病足溃疡（DFU）所致。DF 对患者生命安全及生活质量带来了严重的不利影响，造成巨大经济负担。多种病理机制导致 DFU 愈合困难，其中创面感染是加重病情和阻碍愈合的一个重要因素。DFU 常见革兰阳性球菌感染，尤以金黄色葡萄球菌（S. aureus ）为主，抗生素被用于控制 DFU 感染，但溃疡频繁再发及耐药菌株感染导致单纯使用抗生素效果不佳。

近年来，富血小板血浆（PRP）被广泛用于治疗 DFU 创面，由 PRP 经凝血酶或钙剂激活后形成的富血小板凝胶（PRG）被证实具有良好的抗菌和促修复作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类小分子非编码 RNA，近来研究提示其与 DFU 创面的愈合直接相关，但具体机制尚不清楚。

本研究采用美国创伤愈合学会（WHS）官方杂志 Wound Repair and Regeneration 报道的体外创伤模型，将人角质形成细胞（HaCaT 细胞）和S. aureus  在高糖环境下共培养建立体外高糖感染创伤模型，以贫血小板血浆（PPP）为对照，采用富血小板血浆（PRP），富血小板凝胶（PRG）及 PRG 萃取液（EPG）分别干预模型。使用平板菌落计数法检测 S. aureus  生长变化，使用 CCK8 法测定 HaCaT 细胞的增殖情况，评估 PRP 的抗 S. aureus  活性及对受细菌感染细胞的保护作用。采用 qPCR 检测细胞内 microRNA-21 水平变化，采用 Western blot 检测细胞内 PDCD4 蛋白和磷酸化 NF-κB p65 蛋白的变化，免疫荧光技术监测 p65 在细胞内定位，Elisa 法检测与创面愈合相关的炎症因子 IL-6、IL-10、TGF-β1、TNF-α 的变化情况。

结果显示，S. aureus 浓度依赖性的对 HaCaT 细胞增殖造成抑制（图 1）。与 PPP 相比，PRP，RPG 和 EPG 在 24 h 内均能显著抑制 S. aureus  的生长（P <0.01）。干预到 48 h，PRP 不能显著抑制细菌生长（P >0.05），而 PRG 和 EPG 能够继续显著抑制细菌生长（P <0.01）。在 48 h 内 PRG 和 EPG 抑菌作用相当，干预到 72 小时，PRG 的抑菌作用强于 EPG（P <0.05）（图 2）。EPG 能够浓度依赖性的抑制细胞外 S. aureus  生长，对细胞内 S. aureus  也有显著抑制作用（图 3 ）。20% EPG 能够保护受 S. aureus  感染的 HaCaT 细胞并促进其增殖（图 4）。S. aureus  感染增加 HaCaT 细胞内 PDCD4 及磷酸化 NF-κB p65 蛋白表达；促进 p65 从细胞浆向细胞核转移，激活 NF-κB 信号通路；升高促炎因子 IL-6、TNF-α，降低抗炎因子 IL-10、TGF-β1。而 EPG 干预后，24h 时 HaCaT 细胞内 miRNA-21 水平显著增加，干预至 48 小时增加幅度更明显，同时 PDCD4 及磷酸化 NF-κB p65 蛋白水平下调，抑制 NF-κB 信号通路，IL-6、TNF-α 水平减少和 IL-10、TGF-β1 水平增加（图 5、图 6、图 7）。

研究结果提示 PRP 经凝血酶和钙剂激活后形成的 PRG 能够更长时间发挥抗 S. aureus  作用适用于临床，而 EPG 作为液体形式使用方便、精确，更适合实验室研究。miRNA-21 可能通过 PDCD4 调控 NF-κB 活性，进而影响与创面愈合相关的抗炎/促炎因子表达，从而在 PRP 治疗 DFU 中发挥抗炎和促进愈和作用，提示 miRNA-21 可能是 DFU 修复中炎症调控的重要靶点。
Keywords: platelet-rich plasma, antibacterial, anti-inflammatory, cell proliferation-promoting, diabetic infected wound