摘要：目前，临床上针对于牙髓炎的治疗方式主要是以机械清创为主的根管治疗，虽可终止疾病发展、消除炎症，但无法保留和再生牙髓的功能。随着科学家们对干细胞研究的深入，基于干细胞的牙髓再生治疗已成为实现牙髓再生的新方式，而随着对干细胞作用机制的深入研究，研究人员发现干细胞分泌的外泌体可引导宿主细胞进行组织的修复与再生。在此背景下，利用此方法进行牙髓再生的研究有望成为牙髓再生治疗的新策略。

    近日，由四川大学华西口腔医学院田卫东教授领衔的牙再生研究团队利用化学试剂沉淀法成功提取了来自牙髓组织分泌的外泌体（以下称为 “牙髓组织外泌体”，英文缩写 “DPT-exos”），并结合支架材料在动物体内开展了牙髓组织再生的探索。本研究的总体思路是：利用牙髓组织中外泌体的组织特异性诱导作用及成牙诱导能力，结合牙本质套管（TDM）来仿生牙髓组织内环境，诱导干细胞迁移进入TDM 套管内，并进一步探究募集干细胞进行牙向分化及再生牙髓组织的可行性。为了使实验结果更具参考性，本研究将提取来自牙髓细胞的外泌体（DPC-exos）作为对照，试图比较两种不同来源外泌体的再生牙髓组织的能力差异。

    首先，研究人员对两种外泌体的形态表征、物理特性进行了比较和验证：在电镜下观察到两种外泌体呈典型的茶托样结构 (图 1A)，动态光散射（DLS）检测显示两种外泌体直径都分布于 100-150nm 之间（图 1B），免疫印迹（WB）结果表明两种外泌体都表达特定的表面标记物（CD63、CD9）（图 1C）。这一结果证实了本研究中的两种外泌体符合外泌体的基本特征。随后，研究人员对两种不同来源的外泌体在促进细胞增殖和迁移的特性进行了研究：将两种外泌体分别于根尖乳头干细胞（SCAPs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，通过共聚焦显微镜观察到标记后的两种外泌体能被两种细胞摄取并分布于胞内（图 2A）。

    同时利用 CCK-8 试剂盒与 Transwell 培养板分别检测两种外泌体对两种细胞增殖和迁移的影响，结果显示两种外泌体都能明显的促进两种细胞得增殖和迁移，并且 DPT-exos 的促进作用相比 DPC-exos 更强（图 2B-D）。表明了两种外泌体具有促进细胞的增殖和迁移的作用，这在组织再生的过程中十分重要。

    牙髓组织再生的关键在于矿化的牙本质和新生的血管，为了检测两种外泌体是否具有再生矿化的牙本质和血管的潜能，本研究在体外分别检测了两种外泌体的促进矿化和血管再生的能力。首先，将两种外泌体与 SCAPs 分别在普通培养基和成骨培养基下共培养后用碱性磷酸酶染色（ALP Stain）和茜素红染色（Alizarin Red Stain）检测两种外泌体诱导下 SCAPs 表现出的矿化能力，结果显示 DPT-exos 能在两种培养环境下促进 SCAPs 的矿化能力（图 3A-B）。同时，成管试验结果表明两种外泌体都能促进 HUVECs 的成血管作用，但 DPT-exos 促进血管形成的作用更为明显（图 3C-D）。

    最后，在体外明确 DPT-exos 和 DPC-exos 的牙髓再生潜能后，研究人员构建了以 “细胞归巢” 的方式再生牙髓的模型，以明确该方案在动物体内牙髓再生的潜能。裸鼠实验结果显示，DPT-exos 相较于 DPC-exos 能更加明显地促进根尖部 SCAPs 的迁移，进而进入牙本质套管中并形成牙髓样组织。在 DPT-exos 组的新生组织中，我们观察到有新生牙本质样组织生成和成牙本质样细胞的极性分布，髓核中相较于 DPC-exos 组具有更密集的血管分布和胶原沉积（图 4）。对新生组织进行免疫组化及免疫荧光染色显示，DPT-exos 促进了 SCAPs 在牙本质套管内的成牙、成神经及成血管分化（图 5）。

    以上结果表明 DPT-exos 具有更强的成牙髓能力，可通过诱导根尖部 SCAPs 迁移进入仿生牙髓腔中再生出牙髓样组织。

    综上所述，本研究成功提取到了在牙髓组织分泌的外泌体，并成功利用其再生出了具有组织学结构特性的牙髓样的新生组织，揭示牙髓组织外泌体用于牙髓组织再生具有可行性，为进一步临床牙髓组织再生治疗提供了新的思路和实验依据。
Keywords: exosomes, pulp regeneration, cell homing