目的：识别并验证乙型肝炎病毒（HBV）相关慢性肝炎、肝纤维化/肝硬化和肝细胞癌患者发生发展的新型生物标志物。
方法：基于肝组织病理学诊断，选择健康对照（CON，4 例）、慢性乙型肝炎（CHB ，5 例）乙肝肝纤维化/肝硬化（LF/LC，5 例）及相关肝细胞癌（HCC，5 例）4 组人群肝组织样本，进行高通量测序检测 mRNA 表达谱；进行生物信息学分析，通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）和趋势分析（short time-series expression miner，STEM），筛选出 HBV 相关系列肝脏疾病发生发展过程中关键分子，并通过 GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能分析预测主导基因的生物功能。应用定量逆转录酶聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）及免疫组化（immunohistochemical，IHC）试验验证所选指标表达趋势与高通量测序结果的一致性。然后，利用验证组 200 例血浆样本和测试组 400 例血浆样本，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选靶蛋白的表达水平。采用 ROC 分析衡量所选指标及模型的诊断效能。
结果：

1. mRNA 的差异表达及初步分析：应用柱状图、韦恩图和火山图来描述 mRNA 的表达情况。与对照组相比，慢性乙型肝炎组共检测到 1581 个明显差异表达 mRNA，其中上调的有 901 个，下调的有 2680 个；乙肝肝纤维化/肝硬化组有 2141 个明显差异表达的 mRNA，其中 1493 个上调，648 个下调；在肝细胞癌组，共有 1588 个明显差异表达 mRNA，包括 1130 个上调的 mRNA 和 458 个下调的 mRNA。

2. 筛选慢性乙型肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝细胞癌疾病进展关键分子：对 CON、CHB、LF/LC、HCC 四组样本测序所得的 mRNA 对应基因进行 WGCNA 分析，选择与肝纤维化及肝癌相关的黄绿色、绿色、绿松石色和白色模块；同时对所有 mRNA 进行趋势分析，选择在 4 组中呈递增趋势的趋势集。综合 WGCNA 和 STEM 分析，选择 Shc 衔接蛋白 1（SHC adaptor protein 1, SHC1）、SLAM 家族成员 8 （SLAM family member 8, SLAMF8）、白介素 32（interleukin-32, IL-32）、整合素 β2（integrin subunit beta 2, ITGB2）、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF）、串联 C2 结构域核（tandem C2 domains nuclear, TC2N）、突触足蛋白（synaptopodin, SYNPO）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 2（UDP-glucose pyrophosphorylase 2, UGP2）、含有纤维蛋白样细胞外基质蛋白 1（EGF-containing fibulin extracellular matrix protein 1, EFEMP1）这 9 个指标进行后续诊断标志物分析。

3. qRT-PCR 初步验证 mRNA 表达情况：肝组织 PCR 试验检测所选 9 个指标表达水平，发现 SHC1、SLAMF8、IL-32、ITGB2、MANF、TC2N、SYNPO 和 EFEMP1 在正常、慢性乙型肝炎、乙肝肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌四组中呈逐渐增加表达趋势。应用 qRT-PCR 进一步验证外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）9 个 mRNA 的表达水平，发现 SHC1，SLAMF8 和 IL-32 在四组样本呈递进增高表达趋势。

4. 正常及病变肝组织中 SHC1、SLAMF8、IL-32、ITGB2、MANF 免疫组化染色：积分光密度（IOD）分析显示，SHC1、SLAMF8 和 IL-32 在 HCC 患者的肝脏表达最高，其次是 LF/LC 患者、CHB 患者，健康对照组表达量最低。ITGB2 和 MANF 在 LF/LC 表达量最高，明显高于 CHB 和对照组，但 HCC 患者肝组织中 ITGB2 和 MANF 表达水平下降。

5. 验证集中健康对照、慢性乙型肝炎、乙肝肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌人群基本特征：随着 HBV 相关肝脏疾病病情逐渐严重，男性受试者比例、年龄、AST、铁蛋白、FIB-4、APRI、SHC1、SLAMF8 和 IL-32 水平逐渐升高，而 WBC、PLT 和 ALB 水平逐渐下降。

6. 验证集中 HBV 系列肝脏疾病病程进展相关因素分析：单因素和多因素有序逻辑回归分析结果表明，age、PLT、铁蛋白、SHC1、SLAMF8 和 IL-32 是 HBV 相关系列肝脏疾病发生发展的独立影响因素。

7. 筛选并建立新型生物诊断标志物及诊断模型：基于 3 种 mRNA，结合 age、PLT、铁蛋白建立 APFSSI 模型。在区分慢性乙型肝炎与健康对照组时，APFSSI 模型的最佳诊断界值为 1.624，曲线下面积为 0.966，优于 SHC1（AUC=0.900）、SLAMF8（AUC=0.744）和 IL-32 （AUC=0.821）。以 2.470 作为 APFSSI 的诊断界值，其区分 LF/LC 患者与 CHB 患者的敏感性为 90.0%，特异性为 84.0%，AUC 为 0.924，明显优于 SHC1、SLAMF8 和 IL-32（AUC 分别为 0.812、0.684 和 0.741）。当诊断界值为 3.349 时，APFSSI 模型在区分 HCC 患者和 LF/LC 患者方面显示出 84.0% 的敏感性和 86.0% 的特异性，比其他变量（SHC1、SLAMF8 和 IL-32）具有更好的诊断效能。

8. 在测试集中验证新型生物诊断标志物及诊断模型：测试集中呈递进增加或减少趋势的变量与验证集中的变量一致，APFSSI 模型在鉴别诊断 CHB、LF/LC 或 HCC 患者的诊断性能最高，均优于其他参数。
结论：

1. SHC1、SLAMF8、IL-32 可区分 “HCC 患者与 LF/LC 患者”、“LF/LC 患者与 CHB 患者”、“CHB 患者与健康对照组”。

2. 基于年龄、PLT、铁蛋白、SHC1、SLAMF8 和 IL-32 建立的 APFSSI 模型诊断效能最大，根据相应界值有助于区分 HBV 不同疾病阶段，为 HBV 相关慢性肝炎、肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌患者早期诊断提供依据。

关键词：HBV 相关肝病，转录组测序，Shc 衔接蛋白 1，SLAM 家族成员 8，白介素 32