摘要

目的：自然杀伤（Natural killer，NK）细胞来源的细胞外囊泡（NK cell-derived extracellular vesicles，NK-EVs）在肿瘤免疫治疗领域受到广泛关注，但其大规模生产仍存在挑战，限制了临床应用。本研究旨在开发一种简单高效的NK细胞来源纳米囊泡（NK cell-derived nano vesicles，NK-NVs）制备方法，并评估其细胞毒性和药物递送潜能。 

方法：通过挤压法高效制备NK-NVs，对NK细胞、NK-EVs及NK-NVs进行系统表征和蛋白质组分析。评估NK-NVs的细胞毒性及细胞摄取作用，探究其内化机制。采用共孵育、超声处理、挤压法和电穿孔四种载药策略制备多柔比星负载的NK-NVs（NK-NVs-DOX），全面评估其载药量、粒径、稳定性及细胞毒性。

结果：与超速离心法制备的NK-EVs相比，挤压法制备的NK-NVs在保持EVs样形态和标志蛋白（Alix、TSG101、CD9）的同时，颗粒产率提升402.18倍，蛋白产率增加325.76倍。功能实验表明，NK-NVs通过小窝蛋白介导的内吞途径对肿瘤细胞产生延迟性细胞毒性，且对正常细胞具有选择性保护作用。蛋白质组学分析显示，NK-NVs与NK细胞共享7,366种蛋白，显著多于NK-EVs的5,326种蛋白。挤压法制备的NK-NVs-DOX在pH 5.5条件下药物释放率提高30%，对四种肿瘤细胞系均显著增强抗癌效果，在4℃条件下可稳定储药28天。

结论：挤压法制备的NK-NVs具有低成本、快速、高产的优势，能特异性杀伤肿瘤细胞。其pH敏感性药物释放特性增强了载药稳定性，这些优势使NK-NVs成为具有显著临床潜力的肿瘤免疫治疗与药物递送平台。

关键词 自然杀伤细胞; 纳米囊泡; 细胞外囊泡; 内化; 药物递送; 抗肿瘤治疗